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在现代生物科技领域,CRISPR-Cas9技术已经成为最受欢迎的基因编辑工具之一。这种技术可以用来研究基因功能,疾病诊断和治疗等方面。其中最常用的应用就是构建基因敲除细胞模型。
本文将介绍CRISPR技术的基本原理和操作流程,以帮助您更好地了解和使用这种重要的基因编辑工具。
【资料图】
一、CRISPR技术的基础原理
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术最初是从大肠杆菌中发现的一种天然的细菌防御系统,后来被发现可以被用于基因编辑。
CRISPR-Cas9技术基于一种叫做“RNA导向”的机制(guide RNA, gRNA),这种机制可以让CRISPR-Cas9系统选择性地识别和切割DNA中的特定序列。
这意味着我们可以使用CRISPR-Cas9来精确地编辑细胞中的基因序列,包括基因敲除、插入、替换等等。
二、操作流程
CRISPR-Cas9技术的操作流程分为四个主要步骤:设计gRNA、构建质粒、转染细胞、鉴定细胞。
1.设计gRNA:gRNA是由CRISPR-Cas9系统识别并切割目标DNA的关键部分。我们需要在目标基因中选择一个合适的靶点序列,设计gRNA来引导Cas9蛋白识别并切割该序列。
耐思开发的Quick-KO®基因敲除试剂盒根据已知的人和小鼠编码基因,采用优化的预设计方案,相较于传统方案具有更高的敲除效率。
2.构建质粒:质粒是携带CRISPR-Cas9系统和gRNA的载体。在构建质粒时,我们需要将Cas9基因和gRNA序列克隆到质粒中,并确保它们可以在细胞中稳定表达。
耐思Quick-KO®基因敲除试剂盒中的Cas9质粒和gRNA质粒分别携带Blasticidin和Puromycin/mCherry筛选标记,方便用户进行阳性细胞富集。
3.转染细胞:将质粒转染到目标细胞中,让它们表达CRISPR-Cas9系统并编辑目标基因。转染可以通过电穿孔或者化学转染的方法进行。
此外,针对转染效率低的细胞,也可以选择慢病毒款的耐思Quick-KO®基因敲除试剂盒。
4.鉴定细胞:最后一步是对成功转染的细胞进行筛选,通过PCR和测序的方法,筛选出具有目标基因敲除的细胞。
三、目标细胞类型
CRISPR技术可以用于多种细胞类型的编辑,包括哺乳动物细胞、酵母菌、昆虫细胞和植物细胞等。
其中,人类细胞是最常用的细胞模型之一,可以用于疾病模型的构建、药物筛选和基础研究等方面。
耐思Quick-KO®基因敲除试剂盒主要针对人类细胞、小鼠细胞等哺乳动物细胞开发。
对于不同的目标细胞类型,我们需要根据细胞的特点和CRISPR技术的限制来选择合适的CRISPR-Cas9系统和转染方法。
关键词:
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